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PRÉPARATION DE LIBRAIRIES NGS

ET SÉQUENÇAGE DE NOUVELLE GÉNÉRATION

 

Technologies de séquençage de nouvelle génération fournit un profilage profond et précis du génome et du transcriptome. GENXMAP, expert en préparation d'échantillons, propose la préparation de la librairie pour séquençage, mais le processus de préparation des échantillons varie en fonction du type d'échantillon et du but de l'expérience. Différents types de matériel génétique (ADN ou ARN) ont différents processus de préparation des échantillons. En plus de cela, les différentes applications de NGS ajoutent une autre dimension. Par conséquent, plusieurs questions doivent être posées avant l'expérience afin de déterminer les meilleures méthodes pour optimiser au maximum le processus de préparation de la bibliothèque.  L'objectif de la préparation de la bibliothèque est de convertir les acides nucléiques extraits dans un format adapté à la technologie de séquençage qui correspond le mieux à l'objectif de l'étude. Ceci est fait par fragmenter les séquences ciblées à la longueur souhaitée, suivies de l'ajout séquences d'adaptation jusqu'aux extrémités de ces fragments ciblés. Les adaptateurs peuvent également inclure code à barres, qui identifient des échantillons spécifiques et permettent le multiplexage. La fragmentation peut être effectuée par des méthodes physiques ou enzymatiques. Quel que soit le type de préparation de la librairie, la purification de la librairie (library clean-up) et l'étape de contrôle qualité sont indispensables avant de procéder au séquençage. 

Exemple des préparations de librairies proposées par GENXMAP et leurs applications :

  • Analyse métagénomique

La métagénomique fait référence à l'analyse génomique de l'ADN microbien des communautés environnementales à l'aide d'outils de métagénomique qui permettent l'analyse de microbes non cultivables ou jusqu'alors inconnus. Pour toute analyse métagénomique, une étape fiable de purification de l'ADN à partir de la masse microbienne est essentielle pour l'analyse. L'isolement et l'extraction doivent produire un acide nucléique de haute qualité pour la préparation et le séquençage ultérieurs de la bibliothèque. Il existe différentes méthodes d'analyse de la population microbienne, la métagénomique shotgun ou le séquençage 16s.

 

  1. Métagénomique Shotgun

La métagénomique Shotgun est une méthode de séquençage d'échantillons environnementaux pour examiner des milliers d'organismes en parallèle et échantillonner tous les gènes, fournissant un aperçu de la biodiversité et de la fonction de la masse sélectionnée. GENXMAP choisit la méthode optimisée pour la préparation de la bibliothèque d'échantillons afin de garantir l'amplification des cibles peu abondantes lors de la préparation de la bibliothèque, ce qui est l'une des considérations les plus difficiles dans l'analyse métagénomique.

Notre processus :

  1. Contrôle qualité d'échantillon à la réception

  2. Purification de l'ADN 

  3. Quantification et qualification de l'ADN

  4. Préparation de librairies à l'aide du kit de préparation de librairies

  5. Contrôle qualité de la bibliothèque

  6. Séquençage (250-300 EP)  ;

  7. Analyse de données / analyse bioinformatique

  8. Rapports

 

   2. Préparation de la librairie 16s et séquençage

La métagénomique shotgun est l'étude des génomes fonctionnels des communautés microbiennes, tandis que le but du séquençage 16S est de fournir une analyse phylogénétique basée sur la diversité d'un seul gène ribosomal, l'ARNr 16S, qui est utilisé comme marqueur génomique taxonomique chez les bactéries et les archées. 

Notre processus :

  1. Contrôle qualité d'échantillon à la réception

  2. Purification de l'ADN

  3. Quantification et qualification de l'ADN

  4. Préparation de la bibliothèque à l'aide d'amorces pour les régions variables V3 et V4 du gène 16S

  5. Contrôle qualité de la bibliothèque 

  6. Séquençage (150PE) 

  7. Analyse de données / analyse bioinformatique

  8. Rapports

  • Analyse du génome entier

Le séquençage du génome entier (WGS) fait référence à l'examen complet d'un génome en lisant et en assemblant des fragments courts (150 pb, avec la technologie Illumina) ou longs (jusqu'à 30 kb avec la technologie Oxford nanopore) pour déterminer la séquence complète d'ADN chromosomique (nucléaire) et/ou mitochondrial d'un organisme. Cette technique est généralement utilisée pour déterminer un génome ou un organisme inconnu. Le séquençage de novo fait référence au séquençage d'un nouveau génome lorsqu'une séquence de référence ou de matrice n'est pas disponible. Une fois qu'un génome de novo a été entièrement séquencé, assemblé et annoté, un brouillon ou une séquence de référence commune est généré. 

Notre processus :

  1. Contrôle qualité d'échantillon à la réception

  2. Purification de l'ADN

  3. Quantification et qualification de l'ADN

  4. Préparation de bibliothèques à l'aide d'Illumina TruSeq DNA PCR-Free, PacBio DNA Template Prep (pour la plateforme PacBio), Oxford Nanopore Ultra-Long DNA Sequencing Kits. 

  5. Contrôle qualité de la bibliothèque

  6. Séquençage 

  7. Analyse de données / analyse bioinformatique

  8. Rapports

  • Analyse de l'exome entier 

Exome est un terme utilisé pour décrire la somme de toutes les régions du génome composées d'exons. Le séquençage de l'exome est une méthode basée sur la capture développée pour identifier les variants dans la région codante des gènes qui affectent la fonction des protéines. Le flux de travail typique requis pour séquencer et analyser un exome est le suivant :

Notre processus :

  1. Contrôle qualité d'échantillon à la réception

    Purification de l'ADN

  2. Quantification et qualification de l'ADN

  3. Préparation de la bibliothèque à l'aide d'Agilent SureSelect, du panel d'exomes IDT xGEN, des kits d'exome étendus Illumina Nextera Rapid Capture ou d'Illumina TruSeq Exome

  4. Contrôle qualité de la bibliothèque

  5. Séquençage 2x100 ou 2x150 PE

  6. Analyse de données / analyse bioinformatique

  7. Rapports

 

  • Préparation et séquençage de librairies de transcriptome entier et d'ARNm 

Le terme RNA-Seq fait référence à une approche de séquençage de nouvelle génération qui offre un instantané de l'ensemble du profil du transcriptome ou de l'ARN messager (ARNm) à un moment donné. RNA-Seq permet la détection d'isoformes de transcrits, d'expression de gènes spécifiques d'allèles, de fusions de gènes et de variantes de nucléotides uniques, le tout sans avoir besoin de connaître quoi que ce soit sur la composition de la séquence de l'échantillon.

La plupart des applications de RNA-Seq relèvent de deux grandes catégories : 

 1. Séquençage du transcriptome entier

Le séquençage du transcriptome entier est une mesure instantanée des transcrits complets dans une cellule, y compris l'ARNm et tous les ARN non codants. Le transcriptome entier, permet de déterminer les niveaux d'expression globaux de chaque transcrit, d'identifier les exons, les introns et de cartographier leurs limites. Pour examiner avec précision l'ensemble du transcriptome, la plupart des protocoles de préparation de bibliothèques commencent d'abord par l'élimination de l'ARN ribosomique (ARNr) qui, autrement, occupe la majorité de toutes les lectures de séquençage. En supposant que vous n'êtes pas intéressé par l'ARN ribosomal, la suppression de ces transcriptions permet de concentrer davantage de lectures de séquençage sur les transcriptions qui vous intéressent réellement, ce qui vous donne une sensibilité améliorée envers les transcriptions faiblement exprimées. 

 

 2. ARN messager-Seq ou ARNm-Seq

Messenger RNA-Seq ou mRNA-Seq est un protocole RNA-Seq ciblé qui enrichit pour tous les transcrits polyadénylés (poly-A) du transcriptome. L'ARNm-Seq est une méthode utilisée pour étudier la transcription dans les états pathologiques ainsi que l'expression dans diverses applications basées sur la recherche. Seulement environ 1 à 2 % de l'ensemble du transcriptome est composé d'ARN à queue poly-A, la partie codante du génome. En ciblant l'ARNm, la profondeur de séquençage est améliorée car les ressources sont dédiées au séquençage des gènes codants. Cela facilite l'identification des variantes rares et des transcrits d'ARNm faiblement exprimés. mRNA-seq offre une plus grande profondeur de lecture que le séquençage du transcriptome entier.

 

Le processus GENXMAP dans le séquençage du transcriptome entier est comme ci-dessous ; ​

Notre processus :

  1. Contrôle qualité d'échantillon à la réception

  2. Purification totale de l'ARN

  3. Quantification et qualification de l'ARN

  4. Enrichissement de l'ARNm ou appauvrissement de l'ARNr à partir de l'ARN total 

  5. Fragmentation de l'ARN

  6. Transcription inverse - synthèse du 1er brin d'ADNc

  7. Synthèse du deuxième brin d'ADNc

  8. Ligature des adaptateurs

  9. Amplification

  10. Contrôle qualité de la bibliothèque 

  11. Séquençage (100-150PE)

  12. Analyse de données / analyse bioinformatique

  13. Rapports

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